流式细胞术核心原理与检测技术详解

一、仪器核心结构解析

流式细胞仪由五大核心模块构成流体检测系统：流动室、激光光源、信号检测器、信号放大装置及数据分析单元。该技术可实现每秒数千个颗粒的多参数同步检测，广泛应用于细胞生物学与医学研究领域。

1.1 流体动力聚焦系统
样品流在鞘液包裹下形成稳定层流，通过流速差实现单细胞队列排列。关键技术指标包括：

• 样品进样速率：常规设置0.5-5μL/min
• 鞘液压力范围：4-15 psi
• 细胞间距控制：最小间距达10μm

二、检测系统工作原理

当单细胞流通过488nm激光束时，产生三种特征信号：

2.1 光散射检测

• 前向散射（FSC）：检测角度2-15°，与细胞直径正相关
• 侧向散射（SSC）：90°检测角，反映胞内颗粒度
• 典型应用：区分淋巴细胞（低SSC）与粒细胞（高SSC）

2.2 荧光信号检测

采用PMT光电倍增管检测系统，配置要点：

• 荧光染料激发/发射光谱匹配
• 带通滤光片精度±2nm
• 电子补偿消除光谱重叠

三、数据可视化与分选技术

图1 流式细胞仪及细胞分选技术。在流动单元(1)中，将含有单元样品的流体注入鞘液流的中间。这两种流体具有足够的速度差，使它们不能混合。这允许细胞排列在一个单一的文件，这被称为流体动力聚焦。单个细胞文件通过激光器和探测器阵列(2) ，探测器阵列通过前向散射(FSC)测量细胞大小，通过侧向散射(SSC)测量细胞复杂度和荧光。在电池通过单个液滴(3)中的喷嘴退出流动电池之前，它们或者被提供电荷，或者不被提供电荷。具有电荷的所需单元的液滴被电磁铁(4)重新定向出下行流，进入侧面(5)的收集管。不带电的电池直接掉进废物收集箱。

3.1 信号参数解析

图2 用检验器测量光脉冲。当通过激光时，细胞散射或发射的光被检测为脉冲。细胞通过检验器所需的时间，即飞行时间(tOF) ，是信号的宽度，而脉冲的高度表示光脉冲的最大强度。信号的面积是脉冲的积分，表示电池散射/发射的总光。散射光和电池发出的光都可以表示为宽度(即长度)、高度或面积(即整数)。紫色阴影下的曲线，表示整数或面积。

• 脉冲高度：最大信号强度
• 脉冲面积：积分强度值
• 脉冲宽度：细胞通过时间（典型值3-20μs）

3.2 二维散点图分析

常用组合方案：

• FSC-A vs SSC-A：基础细胞分群
• FSC-H vs FSC-W：双联体鉴别
• PE-Cy5 vs FITC：多色补偿验证

四、FACS分选关键技术

4.1 液滴形成机制

• 压电晶体震荡频率：20-100kHz
• 液滴延迟时间校准：±0.25μs精度
• 分选纯度验证：需达98%以上

4.2 分选门控策略

建议采用三级门控：

1）FSC/SSC排除碎片

2）荧光强度阈值门

3）脉冲宽度单细胞门

应用实例：

在丝状真菌研究中，通过优化FSC-W阈值可有效区分休眠分生孢子（直径2-3μm）与菌丝片段。如图3A所示，野生型烟曲霉分生孢子在FSC-A/SSC-A散点图中呈现典型单细胞群分布，经显微验证分选纯度达92.3%。

图3休眠分生孢子的散射特性。(a)一个典型的二维图，其中 Y 轴上的侧向散射(SCC)和 X 轴上的前向散射(FSC)显示休眠的烟麴霉野生型(CEA10)分生孢子。事件以彩虹伪彩色标度的形式显示，红色代表最高频率，蓝色代表最低频率。使用流式细胞仪软件的门控功能绘制的粗实线是主要为单一休眠分生孢子的门控，经流式细胞仪显微镜检查法验证。指示此门中事件的百分比。(b)直方图，仅显示(A)中休眠分生孢子门的事件。细胞计数显示了这些事件的 FSC 分配。

参考文献：1.Robert-Jan Bleichrodt, Nick D. Read, Flow cytometry and FACS applied to filamentous fungi, Fungal Biology Reviews, Volume 33, Issue 1, 2019, Pages 1-15, ISSN 1749-4613, https://doi.org/10.1016/j.fbr.2018.06.001.

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