【摘要】 在本研究中，我们在巴斯德毕赤酵母中同源表达了三种依赖于ATP的转运蛋白STE6-2p、NEO1-p和YPK9-p，并对其增溶和纯化工艺进行了优化。

膜蛋白在所有有生命的生物体中起着至关重要的作用[1]。尽管过去已经有许多努力来阐明真核生物主要活性转运蛋白的结构和功能，但对这些膜蛋白中的大多数仍然知之甚少[2]。这通常是由于它们的可用性低和处理复杂。

 

在本研究中，我们在巴斯德毕赤酵母中同源表达了三种依赖于ATP的转运蛋白STE6-2p、NEO1-p和YPK9-p，并对其增溶和纯化工艺进行了优化。在纯化过程中连续使用不同的温和洗涤剂和使用亲水性基质使我们能够获得所有三种转运蛋白单一分散和高纯度，从而能够通过冷冻电子显微镜进行初步结构分析。

 

使用各自的底物，我们用ATPase实验测定了所有目标蛋白的比活性。这项研究为进一步研究这类药理上重要的膜蛋白的功能和结构打开了大门。对于 ATP 依赖性转运蛋白的重组生产，巴斯德毕赤酵母被证明是一种非常适合的表达系统，每升表达培养物具有高目标蛋白产量。

 

本研究的所有三种目标蛋白都很容易被温和的去污剂 LMNG 溶解。通过优化的纯化方案，每个纯化步骤具有三个纯化步骤，所有三种蛋白质均以高纯度单分散获得。提高蛋白质完整性和纯度的常见策略是利用亲水性 IMAC 基质并将去污剂更换为 GDN。

 

这种方法对于未来有关体外膜蛋白研究的研究有价值。对于纯化的转运蛋白，我们不仅在体外测定了 ATP 酶活性，还使用冷冻电镜进行了初步结构研究。获得了 STE6-2p [3] 有和没有底物的两种高分辨率结构，以及 NEO1-p 和 YPK9-p 的低分辨率图谱，分别为 11.42 Å 和 13.10 Å。

 

通过将冷冻电镜图谱与其他酵母和真菌的同源结构叠加，鉴定了巴斯德毕赤酵母 NEO1-p 和 YPK9-p 的 P、N 和 A 结构域定位。我们预计单颗粒冷冻电镜数据采集和数据处理的进一步优化将显着提高毕赤酵母 NEO1-p 和 YPK9-p 的分辨率。

 

[1] Chapter 10, in: B. Alberts, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter (Eds.), Molecular Biology of the Cell, fourth ed., 2002.

[2] M. Bogdanov, W. Dowhan, Lipid-assisted protein Folding, J. Biol. Chem. 274 (1999) 36827–36830.

[15] S.E.S.M. Schleker, S. Buschmann, H. Xie, S. Welsch, H. Michel, C. Reinhart, Structural and functional investigationof ABC transporter STE6-2p from Pichia pastoris reveals unexpected interaction with sterol molecules, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 119 (2022), e2202822119, https://doi.org/10.1073/pnas.2202822119.

 

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