胶体金标记抗体（免疫金）制备技术详解：从准备到质检

第一阶段：实验前准备

目标： 确保所有试剂和器皿处于最佳状态，避免污染和干扰。

器皿处理：

所有玻璃器皿（烧杯、试管、搅拌子）必须极致洁净。

推荐方法：用王水（注意：强腐蚀性，需在通风橱内操作！）浸泡30分钟，后用超纯水反复冲洗至中性，烘干。或使用5%二氯二甲硅烷的氯仿溶液硅化处理，防止金颗粒吸附。

塑料耗材（移液枪头、EP管）应使用无尘、全新的。

试剂准备：

胶体金溶液：根据需求选择粒径（如15nm, 20nm, 40nm），确认溶液澄清透明、无沉淀。

CD63抗体：纯度 >95%（IgG类型）。关键步骤：必须提前透析。将抗体装入透析袋，在4℃下 against 0.1-1 mM的NaCl溶液或超纯水透析过夜，以去除盐分、甘油和叠氮钠（NaN₃）等稳定剂。

0.2 M K₂CO₃溶液：用于调高pH值。

10% BSA (牛血清白蛋白) 溶液：用作稳定剂和封闭剂。

1% PEG20000 (聚乙二醇) 溶液：用作稳定剂。

洗涤/储存缓冲液：0.01 M PBS (pH 7.4)，含1% BSA和0.1% PEG20000（或0.05% NaN₃以防腐）。

第二阶段：确定最佳标记条件（以NaCl滴定法为例）

目标： 找到稳定1mL胶体金所需的最小CD63抗体量。

调节pH：取1mL胶体金溶液，用0.2 M K₂CO₃将pH值小心调节至8.0 - 8.5（对于大多数IgG抗体，此pH值高于其等电点pI，使抗体带正电）。

系列稀释：取10支试管，每管加入1mL pH调好的胶体金。向各管中加入不同体积透析后的CD63抗体，使其含量呈梯度下降（如10μg, 5μg, 2.5μg, 1.25μg ...）。

孵育：室温静置10分钟。

挑战实验：每管加入100μL 10% NaCl溶液，轻柔混匀，静置2-5分钟。

判定：观察溶液颜色。保持红色不变的最小抗体量即为最小稳定量。实际标记用量 = 最小稳定量 × 1.1（增加10%保险量）。

第三阶段：正式标记与纯化

目标： 在最佳条件下将抗体结合到胶体金上，并去除未结合的游离抗体。

标记反应：

取所需体积的胶体金溶液，用0.2 M K₂CO₃调节pH至8.2。

在磁力搅拌器缓慢搅拌下，将计算好量的CD63抗体逐滴加入胶体金溶液中。

加完后，继续室温搅拌反应30分钟，使结合充分。

封闭稳定：

加入 10% BSA 溶液，使其终浓度达到 1% (即每10mL反应液加1mL 10% BSA)。继续搅拌15分钟。

加入 1% PEG20000 溶液，使其终浓度达到 0.1% (即每10mL反应液加1mL 1% PEG20000)。继续搅拌15分钟。此步骤可进一步增强复合物稳定性。

离心纯化：

将混合液转移至超离心管中。

离心参数：4°C，12,000 - 15,000 g (相对离心力 RCF) 离心 1小时。

注意：转速需根据胶体金粒径调整。粒径越小，所需转速越高（如5nm金需>30,000g；40nm金约10,000g即可）。给出的参数是20nm左右金颗粒的常用条件。

离心后，小心弃去上清液（内含未结合的抗体、游离的BSA等），管底可见疏松的暗红色沉淀。

重悬：

用含1% BSA和0.1% PEG20000的PBS缓冲液（pH 7.4）轻柔地重悬沉淀，恢复至原体积的1/10。

此步骤可再进行一次低速离心（如8,000 rpm，30分钟）以去除少量聚集的颗粒，取上清即为纯化的金标抗体复合物。

第四阶段：储存与质检

储存：

于4°C避光保存，可稳定数周。

对于长期储存，可加入等体积高纯度甘油，混匀后于-20°C保存，避免反复冻融。

质量检查：

肉眼观察：成功的金标抗体应为清澈透明的红色，无任何沉淀或絮状物。

紫外扫描：用紫外分光光度计扫描400-600nm吸收峰。与未标记胶体金相比，金标抗体的最大吸收峰应有3-5nm的红移。

效能验证：进行免疫层析试纸条测试或Dot Blot，验证其与抗原（如CD63阳性外泌体）的结合活性和特异性。

核心关键点总结：

注意：以上实验步骤，仅供参考，具体实验用量与过程需自行根据实验需要确定。