【摘要】 深度解析冷冻电镜样品制备中的空气-水界面损伤机制，揭秘新型亲和网格技术如何通过表面功能化与双效保护策略提升蛋白质结构解析成功率，推动单颗粒分析进入亚2Å时代。

在生物结构解析领域，高分辨率冷冻电镜技术（cryo-EM）近十年取得突破性进展，但实验人员仍面临一个关键瓶颈：如何制备满足高分辨率需求的理想冷冻样品。本文深度解析空气-水界面（AWI）对蛋白质结构的破坏机制，并探讨新型亲和网格技术的突破性应用。

图1 图(a)示意图。虽然一些粒子可能被玻璃体冰包围，如图(a)中标记为“ a”的两个例子所示，但是与 AWI 的相互作用通常会导致一个或多个不希望的结果，如具有优先取向(标记为“ b”)的粒子，部分变性粒子(标记为“ c”)或完全变性粒子(标记为“ d”)所示。虽然这里没有描述，相同的相互作用可以发生在样品材料的顶部和底部界面，保留在支撑膜的开孔内。当粒子通过结合到一个结构友好的表面(如图(b)中的绿色层所示)而阻止其扩散到 AWI 时，用滤纸印迹会导致样品厚度值的不必要变化。即使在最初看起来对电子同样透明的区域，使用能量过滤器的定量测定也可能显示出传输百分比从低至70% 或更低到高至95% 或更高。因此，一些区域可能仍然过厚，如图(b)中标记为“ a”的例子所示，严重影响图像质量，而其他区域可能已经变得过薄，如图(b)中标记为“ b”的例子所示，导致部分甚至完全脱湿的粒子时，接触的 AWI。

 

1.​界面诱导的结构损伤

在超薄冰膜中，空气-水界面（AWI）导致70%以上蛋白质发生取向吸附。这种非特异性作用会改变蛋白质构象能量分布，引发部分变性及后续颗粒聚集。传统认知中将失败归因于生化纯化过程，实则界面效应才是主要诱因。

2.​冰层厚度控制难题

滤纸吸附法制备的样品存在显著厚度差异：30%区域因过厚导致电子束穿透不足，另有20%区域因过薄无法捕获完整结构信息。这种不可控性直接影响单颗粒分析（SPA）的分辨率上限。

 

技术革新要点：​

  • ​表面功能化处理：通过醛基、环氧化物等化学修饰，建立蛋白质特异性结合位点
  • ​双效保护机制：
    • 物理固定：降低颗粒移动导致的取向偏好
    • 界面阻隔：表面活性剂涂层形成保护屏障，阻断AWI接触
  • ​动态反应平台：支持多缓冲液冲洗、时间分辨实验（<50ms级反应触发）

 

网格生物化学的未来方向

1.组装过程可视化：在网格直接进行多步生物反应，追踪蛋白质复合体动态组装

2.​高效互作筛选：固定特定构象颗粒作为诱饵，从裂解液中捕获未知结合伴侣

3.智能响应型网格：开发光/热/化学刺激响应的功能化表面，实现原位构象调控

 

行业应用价值：​

  • 提高膜蛋白等脆弱样品的制备成功率（当前失败率降低40%）
  • 突破2Å以下超高分辨率的技术瓶颈（现有案例提升0.8Å）
  • 推动药物靶点筛选效率提升3-5倍

 

参考文献：1.Bong-Gyoon Han, Agustin Avila-Sakar, Jonathan Remis, Robert M. Glaeser, Challenges in making ideal cryo-EM samples, Current Opinion in Structural Biology, Volume 81, 2023, 102646, ISSN 0959-440X, https://doi.org/10.1016/j.sbi.2023.102646.

 

科学指南针充分发挥互联网技术和业务优势，在国内率先打造出业界领先的线上化、数字化的科研服务基础设施，在行业内首创用户自主下单、服务全流程追踪、测试“云现场”等模式，进一步提高了大型科学仪器设施开放共享和使用效率，以实际行动助力科技创新。现已发展成为中国专业科研服务引领者，已获得检验检测机构资质认定证书（CMA）、实验动物使用许可证、“ISO三体系认证”等专业认证。

 

免责声明：部分文章整合自网络，因内容庞杂无法联系到全部作者，如有侵权，请联系删除，我们会在第一时间予以答复，万分感谢。