【摘要】 冷冻聚焦离子束薄化技术（Cryo-FIB）可以将厚细胞和组织样品稀释到适合透射镜显像的片状(通常为200~300nm)进行观察。

冷冻聚焦离子束薄化技术（Cryo-FIB）可以将厚细胞和组织样品稀释到适合透射镜显像的片状(通常为200~300nm)进行观察。这种利用Cryo-FIB进行切割稀释的方法，避免了传统切片机冷冻切片技术产生的压缩、褶皱等错觉的困扰，技术难度相对较低，大大提高了样品的重复性和通过率。Cryo-FIB薄化技术通过快速冷冻和高压冷冻技术保存的细胞中大分子复合物的结构信息得到了更好的展示，为进一步的高分辨率识别和结构分析带来了更高的可信度。同时，这些结构存在于完整的细胞中，从而使冷冻电子断层扫描看起来像（Cryo-ET）获取原点接近生理状态的结构信息，不仅可以揭示细胞中大分子复合物的结构及其位置，还可以捕捉其不同功能状态下的结构动态。

 

最近，NatureProtocols杂志上发表的一篇文章阐述了使用Cryo-FIB薄化细胞制备冷冻含水片的实验步骤。（FelixRWagner.etal.NatProtoc.2020年May13)。实验过程主要包括以下步骤:首先在电子显微镜载网上培养细胞，或者直接将培养的细胞滴到电子显微镜载网上，然后快速冷冻，然后观察并确定载网卡环后的冷冻显微镜的切割位置，然后进行Cryo-FIB薄化，然后放入冷冻透射显微镜进行冷冻电子断层扫描显像，最后进行3D重构或其他分析(图1)。

本文除详细的实验步骤外，还阐述了实验中的一些小技巧，作者在本文中应注意以下五点：①当使用Vitrobot仪器快速冷冻时，吸水滤纸应放在载网细胞的背面，而含氟聚合物薄膜应放在正面。(Aclarsheet)，这就避免了细胞在挤压吸水过程中可能被滤纸粘走的情况。LeicaEMGP快速冷冻仪设计的单面吸水更适合这个实验。②为便于在Autogrid卡环后面识别FIB和TEM上的切片方向，在卡环前用marker笔在卡环后面的一端和距离这90。°侧面做2个标记。③FIB和SEM之间的角落是52。°，FIB和载网平面在切割薄化过程中需要有一定的交角，一般为8~15。°，两者之间的交角越小，得到的细胞切片面积就越大。由于不同仪器配备的样品座的预倾角度不同，因此FIB切割前样品台的倾角角度根据实际情况确定。④切割前，需要在腔内保护一层Pt沉积样品。Pt沉积厚度需要从三个方面进行调整:GIS温度、样品平台位置和沉积时间。在Pt沉积之后，FIB显像也需要通过离子束直接释放有机Pt中的挥发成分，使Pt附着在样品表面。⑤由于样品在实验过程中需要在镜腔内放置几个小时，一些污染可能会沉积在先切好的切片表面，所以所有的切片都应该在下样前用FIB小束流(10-30pA)进行短时间的表面清洁。

最后，本文总结了Cryo-FIB技术中常见的质量问题，如载网损坏产生的缝隙或孔洞、切割FIB过程中产生的窗帘效应、切片中的晶体、切片表面的冰污染、切片加热产生的豹斑冰污染、切片中不均匀厚度等。