【摘要】 从各种细胞释放的膜性细胞外小泡（EV）和无膜细胞外颗粒（EP）群体难以捉摸的复杂性为它们的生物学功能和诊断实用性提供了线索。

从各种细胞释放的膜性细胞外小泡（EV）和无膜细胞外颗粒（EP）群体难以捉摸的复杂性为它们的生物学功能和诊断实用性提供了线索。采用优化的多色纳米流式细胞术、结构照明（SIM）和原子力显微镜（AFM）在单个EV/EP水平的敏感检测和癌症细胞分泌物的高通量分析之间架起了桥梁。我们将这些方法应用于由几种不同转化机制驱动的完整细胞释放的颗粒，或应用于因药理学抑制其致癌驱动因素（如表皮生长因子受体（EGFR））而施加治疗压力的细胞。我们证明了EV/EP货物中生物相关元素的高度异质性分布，包括癌蛋白（EGFR）、凝血因子（组织因子）、促转移整合素（ITGA6、ITGA4）、四spanins（CD63）和基因组DNA在癌症细胞整个颗粒分泌体中的分布。我们观察到，用不可逆激酶抑制剂（达科米替尼）靶向EGFR会触发含有DNA的EP/EV亚群的释放，包括携带EGFR和DNA耐酶染色质的颗粒（染色单体）。虽然纳米流式细胞术能够量化整个特定分泌组的变化，但SIM揭示了EV/EP亚群的个体分子形貌，AFM揭示了它们的一些物理性质，包括纳米丝和其他亚结构的存在。我们描述了不同EV亚群的不同摄取率，发现癌症细胞优先内化外体样小的EV，而排除较大EV。因此，我们的研究说明了纳米流式细胞术与高分辨率显微镜相结合的潜力，以探索与癌症相关的EV/EP。排列转化、微环境和治疗应激深刻影响癌症细胞的颗粒分泌体[1]。通过测量绝对荧光团含量进行测定校准可以提高阳性或阴性EV/EP染色模式的定义。在这项研究中，我们还证明了致癌EGFR的急性和不可逆阻断通过增加广谱EV/EP的产生来驱动基因组DNA的细胞释放。虽然早期的研究表明，这可能是一个胱天蛋白酶依赖性过程，最终导致细胞凋亡[2]，但纳米流式细胞术揭示的不同含DNA EV或EP亚群的性质更为复杂，仍有待研究，以进一步将这些颗粒与游离核小体区分开来。40其中一些问题可以通过结合纳米流式细胞术和超分辨率显微镜（SIM或AFM）来解决，这可以揭示单个EV/EP中的纳米结构域和结构特征，并对其起源和组成有更多的了解。纳米流式细胞术结合高分辨率显微镜可深入了解癌症细胞颗粒分泌体的分子、结构和功能多样性。

[1]Choi, D.; Lee, T. H.; Spinelli, C.; Chennakrishnaiah, S.; D’Asti, E.; Rak, J. Extracellular Vesicle Communication Pathways as Regulatory Targets of Oncogenic Transformation. Semin. Cell Dev. Biol. 2017, 67, 11−22.

[2] Rak, J. Extracellular Vesicles - Biomarkers and Effectors of the Cellular Interactome in Cancer. Front. Pharmacol. 2013, 4, 21.