【摘要】 流式细胞术是一种自动化的、基于激光或阻抗的高通量方法，可以非常快速地分析细胞群中单个细胞的多种化学和物理特征。

流式细胞术是一种自动化的、基于激光或阻抗的高通量方法，可以非常快速地分析细胞群中单个细胞的多种化学和物理特征。这是一项极其强大的技术，已经在丝状真菌上使用了40多年。尽管细胞群中的单细胞通常使用该技术在逐个细胞的基础上进行快速分析，但流式细胞术也可用于分析细胞(例如孢子)聚集体或整个小菌落。活的或固定的细胞可以用多种荧光报告子染色，以标记不同的细胞成分或测量不同的生理过程。流式细胞术也适用于通过分析非标记细胞的光散射特性来测量细胞大小、相互作用、聚集或形状。荧光激活细胞分选(FACS)是流式细胞术的一种特殊形式，它提供了一种基于每个细胞的荧光和/或光散射特性将细胞的异质混合物分选到两个或多个容器中的方法。流式细胞术分析细胞相对于显微镜的主要优势是分析速度:每秒钟可以分析数千个细胞或在几分钟内进行分类。流式细胞术的缺点是不能及时跟踪特定细胞，并且通常缺乏与单个细胞相关的空间信息。与显微镜相比，一个很大的优势是当使用流式细胞仪时，具有所需特征的细胞可以被分选用于下游实验(例如，用于生长、感染、酶生产、基因表达分析或“组学”方法)。在这篇综述中，我们解释了流式细胞术和流式细胞术的基本概念，定义了其与显微镜相比的优缺点，并描述了这些强大的技术在丝状真菌中的广泛应用。

图1 眠分生孢子的光散射特性。(一)典型的2D图，其中显示了休眠烟曲霉野生型分生孢子在Y轴上的侧散射(SCC)和在X轴上的前向散射(FSC)。事件以彩虹伪彩色标度的形式显示，红色代表最高频率，蓝色代表最低频率。使用流式细胞术软件的门控功能绘制的粗实线是主要为单一休眠分生孢子的门，该门在流式细胞术后通过显微镜进行了验证。该门的事件百分比已显示。(二)直方图，仅显示(一)中休眠分生孢子门的事件。显示了这些事件的FSC分布的细胞计数。

图1显示了烟曲霉CEA10野生型菌株休眠分生孢子的光散射特性。彩虹伪彩色标度显示事件的计数，红色是最高频率，蓝色是最低频率。

图2 通过门控分离标记细胞亚群。烟曲霉野生型菌株(CEA10)的休眠分生孢子用钙荧光蛋白(CFW)和刀豆球蛋白A (ConA)标记。每个染色的两个亚群被门控，总共4个特定亚群。用355 nm激光激发的和用488 nm激光激发的ConA的荧光强度分别绘制在叶轴和X轴上。列出了每个门的单元数量(占总数的百分比)。使用亚群1的置信区间上限和亚群2的下限(由统计学确定；Vinck等人，2005)，对于每一个标签，盖茨都画在总人口图上。

使用流式细胞术软件，在主要为单个分生孢子的亚群周围画出一个门，通过流式细胞术后的显微镜检查进行验证(图1A)。这个门外的事件可以是三个或更多分生孢子的双重或聚合。两个轴都用对数刻度表示，因为分生孢子有很大范围的SSC和FSC值。图1B示出了已经在图1A的栅极中选择的单元的FSC分布的直方图。图2显示了一个典型的多重标记实验，其中烟曲霉CEA10野生型菌株的休眠分生孢子同时用钙辅氟化物白(CFW)和刀豆球蛋白A (ConA)标记。CFW与几丁质结合，与细胞壁中的甘露聚糖结合。使用统计分析(Vinck等人，2005)，测试总群体中正态分布的混合，我们拟合了每个标记分生孢子群体(CFWe和ConA染色)的两个亚群体，并总共选通了4个结合了CFWe和ConA染色的不同组合的亚群体:具有低CFW和低ConA水平的亚群体(占群体的24.6%)；CFW低，ConA高(3.5%)；CFW高，ConA低(0.6%)；一个具有高CFW和高ConA (5.1%)荧光强度水平。剩余百分比(66.2%)由未标记的细胞、具有聚集细胞的事件或不符合任何亚群体置信区间的单个细胞组成，因为它们由于1000次迭代的自举而非常狭窄。理论上，使用这种方法，人们可以用许多不同的荧光标记标记细胞，以检测罕见的亚群。使用流式细胞仪，这些亚群可以被分类，细胞可以用于下游实验，例如涉及转录组学、蛋白质组学、应激挑战、免疫反应或宿主细胞相互作用。

 

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