【摘要】 利用脉冲水蚤和微纹水蚤进行生物测定，以检测原水样本中的蓝藻神经毒素。

利用脉冲水蚤和微纹水蚤进行生物测定，以检测原水样本中的蓝藻神经毒素。在一个富营养化的水库中，对15个月的浮游植物和芝麻中的蓝毒素进行了分析。以固定50%暴露个体的有效时间（ET50）为终点。在w0之间观察到游泳运动瘫痪。暴露在含有有毒蓝藻的湖水中5e3小时，然后在置于对照水中后24小时内几乎完全恢复游泳活动。在对从水库中分离出来的一株产石杉毒素菌株进行生物测定时，也观察到了同样的效果。回归分析表明，ET50与细胞密度、生物量和虎耳草毒素含量之间存在显著关系，这表明湖水样本中的水蚤瘫痪是由在C.raciborskii中发现的虎耳草毒素引起的。水蚤生物测定法是检测天然样品中速效神经毒素的敏感方法，与小鼠生物测定法相比具有重要优势

 

1.1采样点和浮游植物分析

富尼尔水库建于20世纪60年代，用于发电和娱乐用途，是一座富营养化水库，位于南帕拉巴河谷，靠近雷森德市（巴西RJ）。该水库还为里约热内卢市及其周边地区供水。因此，自2002年以来，对水库进行了蓝藻水华监测（Ferrão-Filho等人，2009年）。我们在大坝附近的一个站点进行了为期15个月的采样计划，包括两个阶段：2005年4月至2006年3月和2006年10月至2007年3月。在每个采样日期，5e20 L原水被转移到冰上实验室，用于测量芝麻毒素和石杉毒素，并用于枝角类的毒性生物测定。水样也用Lugol溶液固定，用于浮游植物分析（Utermöhl，1958）。根据Hillebrand等人（1999年）的说法，通过将每个物种的密度乘以其细胞的平均体积来估计浮游植物生物量（mm3 L-1），并且假设浮游植物细胞的比密度为1.0 g cm3，则比生物量以mg（湿重，WW）L-1表示（Edler，1979年）。

 

1.2. C.raciborskii的培养一株C.raciborskii（CYRF-01）是从储液罐中分离出来的，并在ASM-1培养基（Gorham等人，1964年）中保持，在通气的分批培养中，pH¼8.0，231  C，光照强度为40e50 mE m2 s 1，光照：暗循环12/12 h。该菌株已在其他研究中使用，并据报道可产生萨克森毒素（Ferrão-Filho等人，2007年）。通过每周更换一次培养基，将培养物保持在指数增长阶段。细胞计数在Fuchs-Rosenthal血细胞仪上进行。为了确定平均细胞大小和细丝大小，至少测量了50根细丝，并计算了每条细丝中的细胞数量。CYRF-01菌株的纤丝长度在77和310 mm之间变化（平均SD¼172.75 55.71 mm），细胞长度在7.2和10.9 mm之间变化（平均SD¼9.32 1.14 mm）。细胞生物量的估算方法与浮游植物相同。

 

1.3. 毒素分析：通过将可变体积的水（4e19 L，取决于季节和藻类密度）过滤到玻璃纤维过滤器（德国戈廷根Sartorius）上，获取微囊藻毒素和萨克森毒素样品。利用培养物中的冻干物质对菌株CYRF-01的虎耳草毒素进行了分析。根据FerrãoFilho等人（2009年）中描述的方法，通过HPLC分析微囊藻毒素和萨克森毒素。微囊藻毒素（如果存在）表示为MC-LR当量的浓度（Chorus和Bartram，1999），检测限为0.5 mg L-1。如果存在虎耳草毒素，则表示为STX当量的浓度（大岛，1995年）。仅对STX、NEO和GTX（1-4）变异体进行了分析。虎耳草毒素变体的检测限为：STX¼0.89纳克L-1、NeoSTX¼2.33纳克L-1、GTX-1¼1.03纳克L-1、GTX-2¼0.72纳克L-1、GTX-3¼0.21纳克L-1、GTX-4¼0.24纳克L-1。

 

1.4. 枝角类培养物实验中使用了两种枝角类：一种是从卡罗来纳州生物供应局（美国北卡罗来纳州）获得的D.pulex Leydig克隆，另一种是从巴西里约热内卢的一个贫营养水库分离的M.micrura Kurs克隆，没有蓝藻水华，水质高（Soares等人，2008年；Ferrão-Filho等人，2009年）。在实验之前，这两个物种都作为克隆培养物进行了几代培养，使用矿泉水作为培养基，以镰刀菌（绿藻科）为食物（0.5 mg C L1），在昏暗的光线下，12/12 h光/暗循环和23℃。只有米氏支原体培养物接收到20-30%的过滤湖水，因为之前的研究表明，该物种仅在矿泉水中生长不好（Ferrão-Filho等人，2009）。

 

1.5. 急性毒性生物测定这些生物测定的目的是检测枝角类在含有芝麻籽的水库水和菌株CYRF-01的完整细胞中的固定（即瘫痪）。生物测定分为两个阶段：暴露阶段e，将10名新生儿（>24小时）置于30毫升试管中，暴露在实验浓度（水库原水或在矿泉水中稀释的菌株CYRF-01细胞）下2-3小时，并检查活动游泳次数0.5、1、2和3小时后的个体；以及恢复阶段e，在该阶段中，来自原水和CYRF-01处理的所有个体（包括瘫痪者）被转移到“干净”水（矿泉水þ食品）中，并在15-24小时后进行检查。为了避免由于湖水中溶解的任何其他神经毒性污染物而出现假阳性，对照组（3个重复）只使用过滤过的水库水进行平行试验。在恢复阶段结束时，统计活跃游泳、静止和死亡的个数。

 

图1 在福尼尔水库15个月的采样期内，对D.pulex进行的急性生物测定结果。生物测定分为两个阶段：暴露阶段，即动物暴露于原水（10e100%）中2e3小时；恢复阶段，将动物转移到“清洁水”（矿泉水þ食物）中，并持续24小时。对照组包括暴露于过滤水库水的动物。白色箭头表示从暴露到恢复阶段的过渡。

 

图2 对接触菌株CYRF-01的D.pulex和M.micrura进行急性生物测定的结果。将动物暴露在不同浓度（mg L1）的细胞中3小时，然后转移到“干净水”（矿泉水þ食物）中，并持续24小时。对照组包括暴露在矿泉水þ食物中的动物。白色箭头表示从曝光到恢复阶段的过渡。

 

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