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2025-07-08
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【摘要】 本文系统解析Western Blot实验的完整流程，包括样本制备、凝胶电泳、转膜、抗体孵育及成像检测五大步骤，详细剖析每个环节的操作要点（如裂解液选择、凝胶浓度优化、抗体孵育条件）和潜在影响因素（如样本保存、定量误差、背景干扰）。旨在帮助科研人员规避常见错误，提升实验可重复性和准确性。适用于生命科学领域的研究者优化蛋白分析技术。
WB实验是用于检测特定蛋白质在样品中的表达水平、分子量及修饰状态的一种常规广泛性实验。
在生命科学领域，Western Blot（WB）作为蛋白质分析的 “黄金标准”，是科研工作者探索蛋白奥秘的重要工具。从样本制备到成像检测，每一个步骤都暗藏玄机，任何细微的偏差都可能导致实验结果的巨大差异。
一.样本制备：
1.1实验步骤：
1、细胞/组织裂解：使用RIPA裂解液（含蛋白酶/磷酸酶抑制剂）裂解细胞或组织，离心取上清。
2、蛋白定量：BCA或Bradford法测定蛋白浓度，调整至等量上样。
3、上样缓冲液：加入Loading Buffer（含SDS和β-巯基乙醇），95-100℃变性5-10分钟。
1.2影响因素：
（1）样本来源与保存：不同来源的样本（如细胞、组织等）所含蛋白的种类和丰度存在差异，且组织样本的取材部位和处理时间也会影响蛋白表达。若样本保存不当，例如未及时冻存、反复冻融，会导致蛋白质降解、修饰或聚集，进而影响实验结果的准确性。因此，应根据实验目的选择合适的样本，并在取材后迅速置于液氮中冷冻，然后转移至 - 80℃冰箱长期保存，尽量减少冻融次数。
（2）裂解液的选择与使用：裂解液的成分和浓度直接影响蛋白质的提取效率和完整性。不同的裂解液适用于不同类型的样本和蛋白，如 RIPA 裂解液适合提取总蛋白，但对于一些膜蛋白或核蛋白，可能需要使用特殊配方的裂解液。此外，裂解液中蛋白酶抑制剂的添加量和种类也至关重要，若添加不足，蛋白质会被蛋白酶降解；添加过多则可能影响后续的蛋白定量和电泳。在使用裂解液时，需充分裂解样本，确保细胞或组织完全破碎，同时注意裂解的温度和时间，避免蛋白质变性。
（3）样本处理方式：超声处理、研磨等样本处理方式能提高蛋白质的提取效率，但如果处理过度，会导致蛋白质片段化；处理不足，则蛋白质提取不充分。因此，需要根据样本类型优化处理条件，如超声功率和时间，研磨的力度和次数等。
（4）定量方法的选择：常见的蛋白定量方法有 Bradford 法、BCA 法、Lowry 法等，每种方法都有其优缺点和适用范围。例如，Bradford 法操作简便、快速，但受去污剂等物质影响较大；BCA 法灵敏度高、受干扰因素较少，但耗时较长。若选择不当，可能导致定量结果偏差。应根据样本的特点和实验需求，合理选择定量方法，必要时可采用两种方法相互验证。
（5）标准曲线的绘制：标准曲线是蛋白定量的依据，其准确性直接影响样本蛋白浓度的计算。标准品的浓度梯度设置不合理、加样误差、测量吸光度时的仪器误差等，都会导致标准曲线偏离真实值。因此，在绘制标准曲线时，要使用高质量的标准品，严格按照操作规范进行加样和测量，重复多次取平均值，确保标准曲线的线性良好。
（6）样本中的干扰物质：样本中的核酸、去污剂、还原剂等物质可能会与定量试剂发生反应，干扰蛋白定量结果。在定量前，需要对样本进行适当处理，如使用核酸酶去除核酸，通过透析或超滤等方法去除干扰物质。
二.凝胶制备：搭建蛋白分离舞台
2.1实验步骤：
1、制胶：配制分离胶（通常8%-15%）和浓缩胶（5%），根据目标蛋白分子量选择凝胶浓度。
2、上样：每孔上样20-50μg蛋白，Marker作为参照。
3、电泳：恒压（80V浓缩胶，120V分离胶）至溴酚蓝跑至胶底部。
2.2影响因素：
（1）凝胶浓度的选择：不同浓度的凝胶适用于分离不同分子量的蛋白质。如果凝胶浓度过高，高分子量的蛋白质难以进入凝胶，导致迁移率降低；凝胶浓度过低，低分子量的蛋白质则无法有效分离。因此，应根据目标蛋白的分子量选择合适的凝胶浓度，如分离小分子蛋白可选用 12%-15% 的凝胶，分离大分子蛋白则适合使用 6%-8% 的凝胶。
（2）凝胶制备的操作细节：凝胶制备过程中，试剂的混合比例、聚合时间和温度等因素都会影响凝胶的质量。例如，过硫酸铵和 TEMED 的用量不当会导致凝胶聚合不完全或过快，影响蛋白质的分离效果；聚合温度过高或过低也会对凝胶的孔径和结构产生影响。在制备凝胶时，要严格按照配方准确配制试剂，充分混匀后迅速灌胶，并在适宜的温度下让凝胶充分聚合。
（3）凝胶的均匀性：凝胶的均匀性直接影响蛋白质条带的清晰度和分辨率。若凝胶在制备过程中出现分层、气泡或不均匀聚合，会导致蛋白质迁移异常，出现条带扭曲、拖尾等现象。因此，在灌胶过程中要确保凝胶溶液缓慢、均匀地注入玻璃板之间，避免产生气泡，并等待凝胶完全聚合后再进行后续操作。
三.转膜：确保蛋白完美转移
3.1实验步骤：
1、膜选择：PVDF膜（需甲醇激活）或硝酸纤维素膜（NC膜）。
2、转膜条件：恒流200-300mA，1-2小时（根据蛋白分子量调整时间）。
3、验证转膜效果：可丽春红染色或Ponceau S染色观察蛋白条带。
3.2影响因素：
（1）转膜方法的选择：常用的转膜方法有湿转和半干转，两种方法各有优缺点。湿转效果稳定，转膜效率高，但操作时间较长；半干转操作简便、快速，但对实验条件要求较高，如电流、电压的控制。应根据实验需求和实验室条件选择合适的转膜方法，对于分子量较大的蛋白质，湿转效果通常更好；对于小分子蛋白，半干转可能更为适用。
（2）转膜条件的优化：转膜的时间、电流 / 电压、温度等条件会影响蛋白质的转移效率。转膜时间过短，蛋白质未完全转移到膜上；转膜时间过长，则可能导致蛋白质过度转移或扩散，影响条带的清晰度。此外，过高的电流或电压会产生大量热量，导致蛋白质变性；温度过高也会对转膜效果产生不利影响。在转膜过程中，需要根据目标蛋白的分子量和凝胶浓度，优化转膜条件，并在转膜过程中保持低温环境，可通过使用冷却装置或在冷室中进行转膜。
（3）膜的选择与处理：常用的转膜膜材有 PVDF 膜、硝酸纤维素膜（NC 膜）等，不同的膜材对蛋白质的吸附能力和结合特性不同。PVDF 膜机械强度高、蛋白结合能力强，适用于多种检测方法；NC 膜灵敏度高，但机械强度较差，易破损。此外，膜在使用前需要进行预处理，如 PVDF 膜需用甲醇活化，以增强其对蛋白质的吸附能力。若膜的选择或处理不当，会导致蛋白质结合不牢固，在后续的洗涤和孵育过程中容易脱落，影响实验结果。
四.抗体孵育：开启蛋白检测开关
4.1实验步骤：
1、用5%脱脂牛奶或BSA（磷酸化蛋白建议用BSA）室温封闭1小时，减少非特异性结合。
2、按说明书稀释一抗（常用比例1:500-1:5000），4℃孵育过夜或室温2小时。
3、洗涤：TBST（Tris缓冲液+0.1% Tween-20）洗3次，每次5-10分钟。
4、HRP标记（荧光标记）的二抗（如抗兔/鼠IgG），室温孵育1小时，TBST洗涤3次。
4.2影响因素：
（1）抗体的选择：抗体的特异性、效价和亲和力是影响实验结果的关键因素。选择抗体时，要确保其针对目标蛋白的特异性强，避免与其他蛋白发生交叉反应；同时，要关注抗体的效价和亲和力，效价过低会导致检测信号弱，亲和力不足则可能无法有效结合目标蛋白。此外，还需根据实验需求选择合适的一抗和二抗，如单克隆抗体或多克隆抗体，标记二抗的种类（如 HRP 标记、荧光标记等）。
（2）抗体的稀释与孵育条件：抗体的稀释比例直接影响检测信号的强度和背景的高低。稀释比例过高，抗体浓度不足，检测信号弱；稀释比例过低，则会导致非特异性结合增加，背景升高。孵育的时间和温度也很重要，孵育时间过短，抗体与目标蛋白结合不充分；孵育温度过高，可能会导致抗体变性或非特异性结合增强。在进行抗体孵育时，需要通过预实验优化抗体的稀释比例和孵育条件，如在 4℃下过夜孵育一抗，以获得最佳的检测效果。
（3）洗涤条件：洗涤是去除未结合抗体和杂质的重要环节，洗涤不充分会导致背景过高，影响条带的清晰度；过度洗涤则可能使已结合的抗体脱落，降低检测信号。洗涤液的成分、洗涤次数和时间都需要严格控制，一般使用含有 Tween-20 的 TBST 或 PBST 缓冲液进行洗涤，洗涤 3-5 次，每次 5-10 分钟。
五.成像检测：捕捉蛋白最终信号
5.1实验步骤：
ECL化学发光试剂孵育，凝胶成像系统采集信号（调整曝光时间避免过曝）。
5.2影响因素：
（1）检测方法的选择：根据二抗的标记类型，常用的检测方法有化学发光法和荧光检测法。化学发光法灵敏度高、操作简便，但信号持续时间短，需要及时曝光；荧光检测法可实现多色检测，分辨率高，但对仪器要求较高，且存在荧光淬灭的问题。应根据实验需求和实验室条件选择合适的检测方法，若需要检测低丰度蛋白，化学发光法可能更为合适；若要同时检测多个目标蛋白，荧光检测法则具有明显优势。
（2）成像仪器的参数设置：成像仪器的曝光时间、增益、光圈等参数会影响图像的亮度、对比度和清晰度。曝光时间过长，会导致条带过曝，无法准确分析蛋白表达量；曝光时间过短，则信号强度不足，难以检测到低丰度蛋白。在成像前，需要根据样本的信号强度，优化仪器参数，可通过预实验确定最佳的曝光时间和其他参数设置。
（3）背景干扰：成像过程中的背景干扰会影响结果的分析和判断，如膜上的污渍、非特异性结合的抗体、检测试剂的残留等都会导致背景升高。在成像前，要确保膜表面干净，去除多余的检测试剂；在数据分析时，需要扣除背景值，以获得准确的蛋白表达量。
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