【摘要】 深度解析Confetti荧光标记系统联合流式/成像流式技术，实现淋巴细胞克隆扩增高通量检测，突破传统测序局限，助力肿瘤免疫与疫苗开发研究。

【核心摘要】

随着免疫学研究深入，B/T淋巴细胞克隆扩增与抗原受体多样性分析成为关键课题。传统PCR测序技术存在操作复杂、成本高昂等局限，而基于Confetti荧光标记模型的新型检测方案，结合流式细胞术与成像流式细胞术，为活体样本分析提供高效解决方案。本文将解析该技术原理、实验流程及在肿瘤免疫治疗领域的创新应用。

 

技术原理：Confetti荧光标记系统

Confetti模型通过Cre-loxP重组机制实现细胞谱系示踪（图1A）。单等位基因表达可产生4种荧光蛋白：

  • 核定位GFP（绿色）
  • 胞质YFP（黄色）
  • 胞质RFP（红色）
  • 膜定位CFP（青色）

双等位基因组合可拓展至10种颜色编码（图1B），为追踪细胞分化提供独特标记方案。

图1 五彩纸屑盒的原理图概述和一个或两个纸屑盒存在时可能的颜色组合以及双光子显微照片的示例。

 

实验操作全流程解析

1.样本前处理

采用CD4-CreERT2转基因模型，通过他莫昔芬诱导启动荧光表达，保留细胞原生状态，避免传统分选造成的结构破坏。

2.​流式细胞术门控策略

  • 初级筛选：FSC-A/SSC-A参数区分淋巴细胞群
  • 双峰排除：FSC-A/FSC-H散点图去除粘连细胞
  • 活性检测：PI/7-AAD染料识别活细胞（存活率>95%）
  • 靶向分选：CD4+标记定位T细胞亚群

3.成像流式技术优势

支持单细胞图像采集，可验证膜定位CFP表达特征，特别适用于肿瘤转移细胞追踪研究。

 

技术对比与选择建议

方法

通量

信息维度

适用场景

传统测序法

低

基因序列

小样本受体库分析

流式细胞术

高

表型定量

大规模克隆分布统计

成像流式术

中

形态+定量

转移细胞动态追踪

 

研究显示，两种方法在克隆颜色分布检测中具有高度一致性（R²=0.92），建议根据样本量选择：

  • 10^6细胞：优先流式细胞术

  • <10^4细胞：采用成像流式术

 

创新应用场景

1.​疫苗研发：追踪生发中心B细胞克隆进化

2.​自身免疫病：量化T细胞异常扩增阈值

3.​肿瘤免疫：解析循环肿瘤细胞转移路径

4.​神经科学：小胶质细胞异质性图谱构建

 

参考文献：1.Hagert, C. F.;  Bohn, A. B.;  Wittenborn, T. R.; Degn, S. E., Seeing the Confetti Colors in a New Light Utilizing Flow Cytometry and Imaging Flow Cytometry. Cytometry Part A 2020, 97 （8）, 811-823.

 

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