【摘要】 本文系统讲解了胞外囊泡（外泌体、微囊泡、凋亡小体）的详细分类、生物发生途径、特征标志物，并对比分析了差速离心、密度梯度离心、免疫亲和等多种EV分离方法的优劣，最后提供了包括TEM、NTA、WB在内的EV鉴定表征技术指南，为科研工作者提供一站式研究攻略。

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你可能没听过 “胞外囊泡” 这个名字，但它早已在你的身体里默默工作了几十年 —— 当免疫细胞需要传递敌情、当细胞想清除无用垃圾，甚至当肿瘤细胞悄悄策反健康细胞时，这位直径只有几十到几百纳米的微型快递员，正驮着蛋白、核酸等包裹在细胞间穿梭。

自2010年起，外泌体相关论文数量呈指数级增长，近五年全球年发文量稳定在约5000篇的高位。以中国国家自然科学基金为例，相关项目数从2015年起迅猛增加，2019年达到峰值约600项，此后维持在每年300-400项的水平，证实了该领域的持续火热。

本文将详细讲解：如何从复杂的体液中“抓” 到高纯度的 EV？如何证明EV是EV？无论是科研新手还是行业从业者，都能找到你需要的干货。

 

01胞外囊泡的详细分类与特征

1.外泌体

生物发生途径：详细路径为：细胞膜内陷形成早期内体 → 成熟为晚期内体 → 内膜向内出芽形成多囊泡体 → MVBs与细胞膜融合，将其内部的囊泡（即外泌体）释放到细胞外。

尺寸与形态：直径30-200 nm。在常规TEM制样（干燥）后，因失去水分而塌陷，呈现经典的杯状或茶托状。在冷冻电镜下则保持完美的球形。

标志物：跨膜蛋白CD9、CD63、CD81是常用标志物；腔内蛋白如TSG101、Alix等也是重要鉴定依据。

2.微囊泡

生物发生途径：直接由细胞膜向外出芽、脱落形成。

尺寸与内容：尺寸范围更广（100 nm - 1 μm），内容物与细胞质高度相似，可能包含完整的细胞器（如线粒体碎片）。

3.凋亡小体

来源：细胞程序性死亡过程中，细胞碎裂形成。

特征：尺寸通常较大（1-5 μm），内部包含被随机包裹的细胞器、染色质碎片等。功能主要是被吞噬细胞清除，而非主动通信。

 

02胞外囊泡的分离与鉴定：方法细节与优劣

要开展EV 研究，首先需解决 “如何获取高纯度 EV” 的问题，我们首先对主流的分离方法进行详解：

1.差速离心

经典步骤：300-500 g（去除细胞）→ 2,000 g（去除死细胞）→ 10,000 g（去除细胞碎片）→ 100,000 - 120,000 g超速离心70-90分钟（沉淀外泌体）→ PBS重悬洗涤后再离心一次。

缺点是共沉淀杂质多，如蛋白质聚合物、脂蛋白等。

2.蔗糖密度梯度离心

原理：根据颗粒的浮力密度进行分离。外泌体的典型浮力密度范围为1.13 - 1.19 g/mL。

操作：将样品铺在预先制备好的不连续或连续蔗糖梯度液上，超速离心长时间（如10小时以上），外泌体会在与其密度相等的梯度层中富集，从而与大部分杂质（如蛋白质密度<1.25 g/mL，但部分脂蛋白密度与外泌体重叠）分离。是目前能获得最高纯度外泌体的方法之一。

图注：差速离心与密度梯度离心（经典方法）

除此之外，还可以采取免疫亲和吸附，聚合物沉淀，超滤与尺寸排阻色谱以及场流分离、微流控技术等新兴技术做外泌体分离。

那么获取之后，如何确定鉴定捕获了囊泡呢？

首先，形貌表征（TEM）是鉴定膜结构的金标准。能直观看到囊泡是否存在脂质双分子层。

图注：TEM下呈现杯状或茶托状

粒径分析即NTA，可以通过跟踪溶液中每个颗粒的布朗运动来计算其粒径和浓度。优势在于能提供颗粒浓度信息（如particles/mL），这是动态光散射所不具备的。

动态光散射即DLS：测量的是整体的散射光强波动，对于多分散样品，其结果易被大颗粒干扰，测得的平均粒径通常比NTA偏大。

免疫电镜：将TEM与抗体技术结合。例如，用针对CD63的一抗与样品孵育，再用耦联了胶体金颗粒的二抗进行识别，可在电镜下直接观察到金颗粒定位在囊泡表面，从而特异性鉴定其为外泌体。

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