DNA稳定同位素标记方法

为了充分理解和利用 DNA 的结构多样性，需要原子级的结构信息。X 射线晶体学和核磁共振 (NMR) 是传统上用于解析结构的主要技术，而最近，低温电子显微镜越来越多地用于获取大型生物分子复合物的结构信息。NMR 的主要优势在于可以在分子的天然溶液状态下进行观察，从而能够观察生理条件下的动态事件。

NMR 被广泛用于监测配体结合后的结构变化，以及研究生物大分子在各种介质中的折叠和展开过程。然而，用 NMR 研究核酸比研究蛋白质更具挑战性，这主要是由于其构建块数量有限且光谱特性不利。蛋白质含有 20 种不同的氨基酸，其质子共振信号分散性相对较好，而核酸只有四种构建块，信号重叠严重，糖部分尤其如此。

使用未标记分子和高场 NMR 波谱仪（即 800–900 MHz）可以很好地表征小序列，但要进行完整结构测定或获取较大分子的详细信息，则需要对所需核酸序列进行同位素富集。对于 RNA 分子，同位素富集方法已经很成熟，即化学合成体外转录和体内重组生产 。

此外，还有几种转录后操作可用于获得特定序列和解决 RNA 末端的不均匀性，例如核酶定向切割（锤头、丁型肝炎病毒、Varkud Satellite）、DNAzyme 切割或 RNAseH 切割 。TNMR 是研究溶液中蛋白质和核酸的有效方法。用 NMR 研究核酸比研究蛋白质更具挑战性，这主要是由于构建块数量有限和光谱特性不佳。对于 DNA 分子的 NMR 研究，需要（位点特定）同位素富集以促进特定的 NMR 实验和应用。

在这里，我们全面回顾了用于获得稳定同位素标记 DNA 以及酶促 DNA 合成所需的特定稳定同位素标记构建块的同位素标记策略

图 1. 从微生物中提取标记 rNTP 和 dNTP 的生产通用方案[1]。

用于标记 rNTP、dNTP 和 NMR 光谱的 DNA 合成的生化合成的各种方法，包括化学合成、酶促引物延伸、PCR 和 RCA。通过选择性添加标记核苷酸、智能设计模板和/或省略一个或多个（未）标记核苷酸以抑制进一步延长，可以轻松使用酶促引物延伸合成实现位点特异性标记。

此外，还发现了各种 IIS 型限制酶，它们在其识别位点之外进行切割，可用于实现标记方法的更大灵活性和特定序列的定制合成。

此外，还有几种基于生化途径的策略可用于制备特定或均匀同位素标记的核苷酸，这些核苷酸可用作核酸酶促合成的输入。这些核苷酸可以从在稳定同位素取代的最小培养基上生长的微生物中获得，也可以通过使用戊糖磷酸途径的酶进行体外生物合成获得。

通过体外酶还原，可轻松从 rNTP 合成 dNTP。结合可生产的多种标记 rNTP，这种方法由于多功能性和效率而成为合成标记 dNTP 的首选方法。虽然本文讨论的大多数方法已应用于 DNA 的 NMR 结构研究，但所描述的标记技术可能在其他学科（如分析和材料科学）中得到应用。

[1] Nelissen F H T, Tessari M, Wijmenga S S, et al. Stable isotope labeling methods for DNA[J]. Progress in nuclear magnetic resonance spectroscopy, 2016, 96: 89-108.

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