体外抗菌活性检测

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      仪器型号 高温高压蒸汽灭菌锅、多功能酶标仪、洁净工作台、恒温振 荡器、分析电子天平等(仪器型号见实验报告)
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      服务周期 14.1个工作日
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      项目简介

      一、抗菌实验简介

      体外测定微生物对药物敏感程度的实验,称为抗菌实验,分为抑菌实验和杀菌实验,前者是
      抑制细菌的生长繁殖,但不能杀菌,在药物去除后,微生物还可以继续生长;后者是能杀死微生
      物,在药物去除后,微生物不能再生长繁殖。

      二、抗菌实验检测方法

      1. 液体培养抑菌检测(OD值测量 )
       实验操作:
                 分别于LB培养基中220 rpm ,37℃条件下培养大肠杆菌DH5α至OD600为0.6左右,对应108个CFU/mL的浓度,按
      1:1000的稀释比例将菌液稀释至终浓度为105个CFU/mL,分别将15w紫外照射灭菌20分钟的待测样品加入到3 mL的菌
      液中(每组设定两个平行重复,样品均完全浸没于菌液中),37℃,220 rpm条件下培养24 h后测定OD值。

      对接注意事项:
                 1.样本自带对于OD测试有有影响的因素,对于实验结果有影响;
                 2.默认三次重复,确认待测样本的实验用量;
                 3.对于块体样本,计算好客户提供样本数量;

      2. 固体平板培养基抑菌检测(抑菌圈测量)
      实验操作:
              分别于LB培养基中220 rpm ,37℃条件下培养大肠杆菌DH5α至OD600为0.6左右,108个CFU/mL的浓度,
      以1:1000的体积比将菌液和融化的固体培养基混合,每个培养皿(直径为90 mm)中倒入10 mL混合培养基,
      凝固后备用。分别加入待测样品,37℃培养24小时候拍照。

      实验方法:
                a.直接接触法;b.滤纸片法;c.打孔法;d.挖沟法

      3. 平板涂布计算菌落数(抑菌率测定)
      实验案例:
      首先分别于LB培养基中220 rpm ,37℃条件下培养两种菌体(大肠杆菌DH5α,金黄色葡萄球菌 
      CMCC26003)至OD600为0.6左右,对应108CFU/mL的浓度。随后将25 μL 浓度约为 107 CFU/mL 的细菌悬浮液
      滴加到一块2.54 cm×2.54 cm的棉织物中间位置,然后将另外一块相同大小的棉织物放在上面,并用重物压紧
      使得细菌和棉织物能够充分接触。经过 5、10 和 30 min 的接触时间后,然后将这两块棉纤维加入到含有一定
      浓度的硫代硫酸钠溶液(这个硫代硫酸钠溶液中包含有 9.5 mL的磷酸缓冲液和 0.5 mL的0.05M的硫代硫酸钠溶
      液)的离心管中,4500g,离心 240 s。离心结束后将棉织物取出,然后吸取离心管中的溶液100μL此打到铺有
      琼脂的平板上接种到营养琼脂培养板上,在 37 oC 温度下培养 24 h,通过菌落计数法来评价抗菌性能。  

      4. MIC测试:对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌样品被两倍稀释法测量。样品加入到LB液体中形成均匀的悬
      浮液,然后两倍稀释成不同的浓度。每个1毫升的培养基含有不同浓度的测试样本接种0.1毫升106 CFU/ML细
      菌悬液, 37◦C下震荡培养24小时,然后观察细菌的生长,不加抗菌样品的试管作为对照,无菌生长的实验
      管液体透明,以不长菌管的抗菌剂量为该抗菌剂的MIC。

      5. MBC测试 :对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌样品被两倍稀释法测量。样品加入到LB液体中形成
      均匀的悬浮液,然后两倍稀释成不同的浓度。每个1毫升的培养基含有不同浓度的测试样本接种0.1毫
      升106 CFU/ML细菌悬液, 37◦C下震荡培养24小时,然后观察细菌的生长,不加抗菌样品的试管作
      为对照,无菌生长的实验管液体透明,取其中0.1ml培养液涂布新鲜琼脂平板,37℃下培养24h,观
      察无菌落生成,无菌落生成的最低样品浓度计量为该抗菌剂的MBC。

      结果展示

      1. OD值测试展示

      2. 抑菌圈检测抗菌活性

      2. 共培养+平板涂布检测抗菌活性

      3. MIC测试展示

      由测试结果可知,样品A的MIC为8μg/ml,对照药环丙沙星的MIC为0.25μg/ml,样品A的MBC为16μg/ml。

      样品要求

      样品颜色过重,造成OD值法测试结果无法判断出样品是否具有抗菌性 

      固体块状样本测试面没有标注,造成测试面错误 

      凝胶样品放于37℃恒温培养箱中出现融化情况 

      样品在培养基振荡培养时,有溶解的现象出现,颜色较重,无法依据OD值判定样品抗菌性能。 

      常见问题

      1. 抗菌活性可以测试哪些指标呢?该怎么选择呢?

      OD值、抑菌圈、振荡+平板涂布计数法 、MIC、MBC。

      1、OD值测试(适合无颜色干扰、可溶性样品);

      2、抑菌圈测试(适合活性成分可以溶出的样品);

      3、振荡培养+平板涂布计数法(可用于不溶性样品抗菌活性评价);

      4、MIC测试(适合已验证过具有抗菌活性且无颜色干扰的可溶性样品);

      5、MBC测试(适合已检测过具有最小抑菌浓度的样品);

      *如果之前没有做过抗菌实验,建议先做简单的抑菌圈或者OD值评估下抗菌效果。

      2. 都有那些菌株呢?

      标准菌株常用的是金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、粘性放线菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌等。其他的菌株您可以和科学指南针的工作人员联系,我们也可以提供。

      3. 如何选择待测菌株?

      革兰氏阴性菌代表:大肠杆菌(大肠埃希菌)、铜绿假单胞菌(绿脓杆菌);
      革兰氏阳性菌代表:金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌;
      真菌代表:白色念珠菌(白色假丝酵母)。

      4.

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