实时荧光定量PCR

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      实时荧光定量PCR

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      仪器型号 13
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      服务周期 5.0-20.0日完成

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      项目简介

      实时荧光定量PCR是以DNA或者cDNA为模板进行扩增、并加入荧光基团进行定量,用于检测DNA或者RNA含量,可研究某个基因在经过特定处理后转录水平的变化情况。qPCR在基因表达研究和临床疾病检测等领域已得到广泛应用,如转基因动植物检测、病原微生物或病毒含量检测、癌症检测以及药物反应个体差异的遗传基础检测、基因差异表达和基因分型等。

      实时荧光定量常用的方法有SYBR Green I法和Tag Man探针法。目前绝大多数出于实验需要和成本的原因会优先考虑染料法。

      荧光染料法:实验设计简单(仅需2个引物,无需设计探针),初始成本低,灵敏度高,但需要进行熔解曲线分析检验扩增反应的特异性。适用于非特异性检测(专一性要求不高或高通量检测)。

      探针法:有高特异性(引物和探针共同于模板结合),高信噪比,能进行多重反应。但成本高,实验设计繁琐。适用于扩增序列专一检测。

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      结果展示

      1.仪器展示

      2.实验结果展示

       

       

      样品要求

      送样须知

      1.寄送样本可以为细胞、细菌、真菌、动植物组织等。为了保证提取的遗传物质足够,样品数尽可能准备充足。

      2.样品为纯细胞或细菌样,离心后获得沉淀黄豆大小为宜,若样品为水样等未知菌量样本,需要提供至少1L的水样或寄送装有过滤定量水样的滤膜(4°C),干燥寄送,如果其他样品寄送需求,请于指南针工作人员沟通确认!

      3.待测样品为RNA样品及cDNA样本,接收后需先进行质检,质检合格的开展后续项目。

      4.客户需要提供检测基因的序列和引物序列,若基因序列来自文献等其他途径,可以多参考几组,避免引物特异性不足,延长实验周期。

      5.不接受具有致病性的样品。

      需要提供

      1. 待测样品(原始样品或者RNA或者cDNA,原始样品可由我们代处理,RNA样品及cDNA样本接收后需先进行质检,质检合格的开展后续项目);

      2. 提供所需的引物/标准品(也可由平台代设计及合成);

      3. 其他所涉及的细胞、试剂盒以及生物耗材等平台都可以有偿提供。

      服务周期

      实验周期为收到样品后1-2周左右,具体实验周期请预约前与指南针工作人员沟通确认,谢谢!

      交付内容

      实验报告(包括仪器设备厂家型号、试剂品牌货号、实验方法、实验步骤、引物信息、试剂、仪器及扩增曲线、溶解曲线、数据分析结果等),原始数据及图片。

      常见问题

      1. 绝对定量和相对定量的区别?

      绝对定量指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本的量。绝对定量的标准样品一般是指含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒、含有和待测样品相同扩增片段的cDNA,PCR的产物,把它们分别稀释为不同的浓度作为模板进行反应。横坐标为标准品拷贝数的对数值, 纵坐标为得到的CT值,可做出标准曲线,根据未知样本的CT值,可在标准曲线中得到样本的拷贝数进而对未知样本进行定量。

      相对定量是在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化,也就是比较经过处理的样本和未经处理的样本之间的相对基因表达差异,常用方法有标准曲线法和2 -△△CT法;其结果必须用内对照基因(管家基因)校正;管家基因通常指维持细胞基本代谢活动所必须的基因,如GAPDH/Actin/18s rRNA等,实际操作中可依据文献或具体实验进行筛选。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例,而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。

      2. 内参基因如何选择?

      1. 建议选取2-3种内参基因,每种内参基因有2对引物进行上机实测;
      2. 内参的反应条件要尽量向目的基因看齐,以确保目的基因的扩增效率。

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