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      体外抗菌检测

      电话:400-831-0631

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      结果展示

      样品要求

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      体外抗菌检测

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      仪器型号 高温高压蒸汽灭菌锅、多功能酶标仪、洁净工作台、恒温振 荡器、分析电子天平等(仪器型号见实验报告)
      预约次数 70次
      服务周期 收到样品后平均4.2-8.3工作日完成

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      项目简介

      简介

      体外抗菌实验:体外条件下,测定细菌/真菌对测试样品的敏感程度。体外抗菌实验分为抑菌实验和杀菌实验,抑菌实验可测定仅有抑制细菌/真菌生长繁殖而无杀灭作用的测试样品;杀菌实验可测定不仅抑制而且能杀灭细菌/真菌的测试样品。

      <1>抑菌实验方法有OD值法、抑菌圈法、共培养+平板涂布计数法(一般培养环境为细菌/真菌培养基)、MIC。

      <2>杀菌实验方法有共培养+平板涂布计数法(一般培养环境为PBS/生理盐水溶液)、MBC。

      一、抑菌圈测试

      (1)实验原理

      供试材料含可溶性抗菌成分,此成分在琼脂培养基中可自由扩散,形成一定浓度的含药区域。由于各种微生物对不同材料或同一材料不同浓度的敏感性不同,因而形成不同大小直径的抑菌圈。

      (2)参考标准

      GBT39101-2020-多肽抗菌性测定 抑菌圈法

      NCCLS 药敏试验标准 纸片扩散法

      (3)实验流程图

      二、 OD值测试

      (1)实验原理

      细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成正比,通过OD值可以定性反映出微生物的浓度或数量。

      不同材料按比例与菌液共培养一定时间后,通过比较不同组别(不同材料、不加材料)菌液OD值之间的大小来判断不同材料的抗菌性能。

      (2)实验流程图

      三、平板涂布计数测试

      (1)实验原理

          不同材料与菌液共培养一定时间后,不同组别(不同材料、不加材料)的菌液稀释一定倍数后涂布平板,以计算出不同组的菌液浓度。通过与对照组比较,进而计算出实验组菌液浓度下降百分比,即得到材料对测试菌株的抗菌性能。

      (2)参考标准

      GBT 31402-2015 塑料 塑料表面抗菌性能试验方法

      JCT 1054-2007 镀膜抗菌玻璃

      GBT 20944.3-2008 纺织品抗菌性能的评价 第3部分震荡法

      GBT 21510-2008 纳米无机材料抗菌性能检测方法

      GB/T 23763-2009  光催化抗菌材料及制品抗菌性能的评价

      (3)实验流程图

      四、MIC/MBC测试

      (1)实验原理

      将样品稀释成不同浓度(二倍稀释法),加入到微孔板/无菌试管中,在每个孔/试管中加入一定浓度的测试菌,培养一定时间后肉眼观察培养液的混浊情况,如果是澄清的,说明没有细菌的增长,即细菌的生长得到了抑制,培养液澄清的最小样品浓度为最小抑菌浓度,即MIC。

      然后将澄清孔/管(3个样品浓度)取出涂布于培养基表面,若无细菌生长,则说明测试的菌已经被杀灭,此时的样品浓度为最小杀菌浓度,即MBC。

      (2) 参考标准

      YY/T 0688.1-2008临床实验室检测和体外诊断系统 感染病原体敏感性试验与抗菌剂敏感性试验设备的性能评价

      GB/T27623.1-2011 渔用抗菌药物药效试验技术规范 第1部分:常量肉汤稀释法 药物敏感性试验

      (3)实验流程图

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      结果展示

      1、抑菌圈测试结果

       

      抑菌圈结果解读:

      (1)抑菌圈测试一般用作样品抑菌性能的定性测试。若产生抑菌圈,则说明样品有一定的抗菌性。若无抑菌圈产生,说明该测试方法条件下样品无抗菌性。

      (2)针对液体样本可能与浓度呈正相关,但并不意味着样本浓度越高,抑菌圈越大。因为测试样本对指定的测试菌株有一定的抑菌阈值,且抑菌性还与样本本身扩散性有关。

      (3)取出培养完成的平板,采用十字交叉法,用游标卡尺测量抑菌圈(透明圈)直径(mm),以直径表示抑菌圈的大小。

      抑菌圈直径(mm)=抑菌圈外径(mm)—样品直径/打孔孔径(mm)

      2、OD值测试结果

        分组

      OD600

      Average

      1次平行

      2次平行

      3次平行

      control

      0.658

      0.783

      0.636

      0.665

      0.812

      0.637

      0.724

      0.752

      0.637

      0.700

      sample

      0.449

      0.399

      0.476

      0.495

      0.428

      0.463

      0.528

      0.357

      0.484

      0.453

      注:与对照组比较,**P<0.01

      OD值测试结果解读

      (1)通过差异性分析,**P<0.01代表实验组与对照组相比,有极显著性差异;*P<0.05代表实验组与对照组相比,有显著性差异;P>0.05代表实验组与对照组相比,无差异性。

      (2)若OD600值实验组与对照组有极显著/显著性差异减小,则说明材料对测试菌株有抗菌性。

      3、平板涂布计数测试结果

      分组

      菌落数

      稀释倍数

      菌液浓度(CFU/mL)

      抑菌率

      对照

      237

      106

      2.37×109

      /

      1

      217

      105

      2.17×108

      90.84%

      平板涂布测试结果解读:

      (1)结果表格中菌落数为各组相应稀释倍数下的菌落计数结果,计数原则依据国家标准GB4789.2-2016,选取菌落数在30 CFU~300 CFU之间来进行菌落计数。在最小稀释倍数下,若仍无菌落生长,则证明样品抑菌效果非常明显。

      (2)菌液浓度(CFU/mL)计算方式:菌落数×稀释倍数×10(0.1 mL稀释液涂布平板)

      抑菌率=(1-实验组菌液浓度/对照组菌液浓度)×100%

      4、MIC/MBC测试结果

      MIC/MBC测试结果解读:

      (1)MIC(最小抑菌浓度,Minimal inhibition concentration)判定标准:眼观无细菌生长的最低药物浓度确定为MIC。

      (2)MBC(最小杀菌浓度,Minimum bactericidal concentration)判定标准:眼观清澈的孔/管摇匀, 吸取0.1 mL涂布于固体培养基,培养一定时间后计数,菌落数少于5个的最低稀释样品浓度确定为MBC。

      样品要求

      一、抑菌圈测试

      (1)块体类—薄膜、布料、金属块、纸片、凝胶等

      送样量至少每种菌提供3个样品

      制样要求:金属块、凝胶类样本须制备成统一大小的圆形/方形,建议制备直径为6-10 mm圆形。布料、纸片类样本可代为裁剪,默认制备直径为6 mm。

      <注:凝胶样本须保证样本在培养条件下(一般为37℃)不融化>

      (2)液体类

      送样量:根据测试时样本浓度而定:

      ①若采用原液测试,则样本量为1 mL/种菌;

      ②若采用稀释后样本测试,则须告知稀释倍数及稀释液,样本量为1 mL/稀释倍数/种菌。

      (3)粉末类

      送样量:因不同样本密度不同,无法保证每个加样孔均能加入等量样本,故建议样本做分散液,按照等体积加样(每个孔最大加样量为0.2 mL),能提升样本量的一致性。需要提供质量/体积比(选择合适的样本分散液),样本量为质量/体积×1 mL/种菌。

      <如果不可使用分散液,需要预试,样本量可联系本公司人员确认>

      二、OD值测试

      (1)块体类—薄膜、布料、金属块、纸片、凝胶等

      送样量:需要提供样本与菌液的培养体系。比如X g样本/mL菌液,样本量为4X g/种菌。

      (2)液体类(要求样本溶液无色或者淡色

      送样量:根据测试时样本的溶剂和浓度而定:

      ①若溶剂具备杀菌性(如DMSO、乙醇、甲醇、DMF等),推荐提供样本浓度为50倍测试浓度,样本量为0.1 mL/种菌。

      举例:测试材料的溶剂为DMSO,测试浓度为2 mg/mL。则需提供样本为100 mg/mL浓度的样本0.1 mL/种菌。

      ②若溶剂不具备杀菌性(如PBS、纯水、生理盐水等),推荐提供样本浓度为10倍测试浓度,样本量为0.4 mL/种菌。

      举例:测试材料的溶剂为纯水,测试浓度为2 mg/mL。则需提供样本为20 mg/mL浓度的样本0.4 mL/种菌。

      <注:如果提供样本原液浓度高于推荐浓度,可按比例计算样本量>

      (3)粉末类

      送样量:需要提供样本与菌液的培养体系。比如X g样本/mL菌液,样本量为4X g/种菌。

      三、平板涂布计数测试

      (1)块体类—薄膜、金属块、镀膜玻璃等(具备一定的表面积)

      测试方法参考国标GBT 31402-2015 塑料 塑料表面抗菌性能试验方(https://max.book118.com/html/2017/1123/141231780.shtm)、JCT 1054-2007 镀膜抗菌玻璃(https://www.antpedia.com/standard/5144389-1.html)

      送样量:样本量为1个/次重复/种菌。

      样本尺寸:标准尺寸大小5×5cm,建议最小尺寸1×1cm。

      (2)液体类

      送样量:根据测试时样本的溶剂和浓度而定:

      ①若溶剂具备杀菌性(如DMSO、乙醇、甲醇、DMF等),推荐提供样本浓度为50倍测试浓度,样本量为0.03 mL/次重复/种菌。

      举例:测试材料的溶剂为DMSO,测试浓度为2 mg/mL。则需提供样本为100 mg/mL浓度的样本0.03 mL/次重复/种菌。

      ②若溶剂不具备杀菌性(如PBS、纯水、生理盐水等),推荐提供样本浓度为10倍测试浓度,样本量为0.1 mL/次重复/种菌。

      举例:测试材料的溶剂为纯水,测试浓度为2 mg/mL。则需提供样本为20 mg/mL浓度的样本0.1 mL/次重复/种菌。

      (3)粉末类

      送样量:需要提供样本与菌液的培养体系。比如X g样本/mL菌液,样本量为X g/次重复/种菌。

      四、MIC/MBC测试

      (1)粉末/液体类(要求样本溶液,完全溶解且无色或者淡色)-微孔板法

      送样量:根据测试时样本的溶剂和初始工作浓度而定:

      ①若溶剂具备杀菌性(如DMSO、乙醇、甲醇、DMF等),推荐提供样本浓度为50倍测试浓度,样本量为0.03 mL/种菌。

      举例:测试材料的溶剂为DMSO,测试浓度为2 mg/mL。则需提供样本为100 mg/mL浓度的样本0.03 mL/种菌。

      ②若溶剂不具备杀菌性(如PBS、纯水、生理盐水等),推荐提供样本浓度为10倍测试浓度,样本量为0.1 mL/种菌。

      举例:测试材料的溶剂为纯水,测试浓度为2 mg/mL。则需提供样本为20 mg/mL浓度的样本0.1 mL/种菌。

      <注:如果提供样本原液浓度高于推荐浓度,可按比例计算样本量>

      如果样本为粉末,可按照浓度和所需体积计算样本量(<10 mg者,需称量并标记清楚,避免样本量较少情况下再反复称量造成损耗)。

      (2)粉末/液体类(样本颜色较重)-平板法

      送样量:根据测试时样本工作浓度和浓度个数而定。比如工作浓度为X g/mL(或µM),测试n个浓度,样本量为60X*n g(或10X µM的液体样本6*n mL)

      (3)液体类(样本属于分散液或制备成分散液,且呈无色或者淡色)-试管法

      送样量:根据测试时样本工作浓度而定

      ①若分散剂具备杀菌性(如DMSO、乙醇、甲醇、DMF等),推荐提供样本浓度为50倍测试浓度,样本量为2 mL/种菌。

      举例:测试材料的分散剂为DMSO,测试浓度为2 mg/mL。则需提供样本为100 mg/mL浓度的样本2 mL/种菌。

      ②若分散剂不具备杀菌性(如PBS、纯水、生理盐水等),推荐提供样本浓度为10倍测试浓度,样本量为10 mL/种菌。

      举例:测试材料的分散剂为纯水,测试浓度为2 mg/mL。则需提供样本为20 mg/mL浓度的样本10 mL/种菌。

      (4)粉末类(直接加样)-试管法

      送样量:根据测试时样本的工作浓度而定。比如工作浓度为X mg/mL(g/mL),则样品量为30X mg(g)/种菌。

      常见问题

      1. 抗菌活性可以测试哪些指标呢?该怎么选择呢?

      OD值、抑菌圈、振荡+平板涂布计数法 、MIC、MBC。

      1、OD值测试(适合无颜色干扰、可溶性样品);

      2、抑菌圈测试(适合活性成分可以溶出的样品);

      3、振荡培养+平板涂布计数法(可用于不溶性样品抗菌活性评价);

      4、MIC测试(适合已验证过具有抗菌活性且无颜色干扰的可溶性样品);

      5、MBC测试(适合已检测过具有最小抑菌浓度的样品);

      *如果之前没有做过抗菌实验,建议先做简单的抑菌圈或者OD值评估下抗菌效果。

      2. 如何选择待测菌株?

      革兰氏阴性菌代表:大肠杆菌(大肠埃希菌)、铜绿假单胞菌(绿脓杆菌);
      革兰氏阳性菌代表:金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌;
      真菌代表:白色念珠菌(白色假丝酵母)。

      3. 寄送样品量不足

      如果寄送样品量不足,会造成反复寄样,影响您的实验周期。所以建议根据上述的《样品要求》准备样品量,若遇到样品量不太确定时,可与工作人员联系。

      4. 灭菌方式如何选择?

      灭菌方式的选择可参考下图建议,但紫外照射灭菌存在灭菌不彻底风险,尤其是粉末、棉布、多孔材料等样品。

      5. 哪些实验需要提供工作浓度(即样品量/菌液量)?

      OD值、共培养+平板涂布计数、MIC/MBC,这些测试必须提供工作浓度。

      6. 对照设置问题

      抑菌圈测试,可选择以不加样品的菌落培养板为空白对照,可免费提供,或者若样品为纸片或者样品需要溶解,可提供滤纸片或者样品的溶剂作为空白对照,可免费提供。

      OD值测试,默认对照为不加样品的等量菌液;

      共培养+平板涂布计数测试中。a.常规抗菌实验:若样品是液体,平台可有偿提供不加样品的等量菌液为空白对照;若样品是固体,菌液加于固体样品表面看抑菌效果,平台可有偿提供将等量菌液直接加到平板或者孔板中的空白对照。b.黏附/抗黏附实验:与您材料的粘附性质有关,必须由您提供不加抗菌成分的对照样品作为空白对照。

      MIC/MBC测试,默认对照为添加等浓度的溶剂。

      7. 抑菌实验与杀菌实验有何区别?

      抑菌实验(默认)—测试样品对细菌是否具有抑制生长作用,测试时培养环境为培养基,即测试过程中细菌可以继续生长繁殖。

      杀菌实验—测试样品对细菌是否具有杀灭作用,测试时培养环境为PBS/生理盐水,即测试过程中细菌不再生长繁殖。

      8. MIC和MBC测试分为微孔板法、试管法、平板法,有哪些区别?

      MICMBC测试分为微孔板法(微量肉汤稀释法)、试管法(常量肉汤稀释法)、平板法(琼脂稀释法)。

      1. 微孔板法

      方法:将样品用培养基/PBS/生理盐水稀释成不同浓度(二倍稀释法),加入100μL到微孔板中,在每个孔中加入等量一定浓度的测试菌液(100μL),培养一定时间后肉眼观察培养液的混浊情况。

      结果判断:以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。选取1/2MIC浓度、MIC浓度、2×MIC浓度等浓度孔,各吸取100μL培养液涂布至固体培养基,培养一定时间后计数,菌落数少于5个的最低稀释样品浓度确定为MBC。

       

      2. 试管法

      方法:将样品用培养基/PBS/生理盐水稀释成不同浓度(二倍稀释法),加入一定量的样品溶液(0.5-1.5mL)到无菌试管中,在每个试管中加入与样品溶液等量的一定浓度测试菌液(0.5-1.5mL),培养一定时间后肉眼观察培养液的混浊情况。

      结果判断:以肉眼观察,药物最低浓度试管无细菌生长者,即为受试菌的MIC。选取1/2MIC浓度、MIC浓度、2×MIC浓度等浓度孔,各吸取100μL培养液涂布至固体培养基,培养一定时间后计数,菌落数少于5个的最低稀释样品浓度确定为MBC。

       

      3. 平板法

      方法:配置固体培养基,高温灭菌处理。待温度冷却降至一定温度(一般为50℃左右)时,将不同剂量的测试样品(一般为溶液)加入混匀,制成含不同递减浓度测试样品的平板。接种受试菌,孵育后观察平板上细菌的生长情况。

      结果判断:将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点,以与对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度为MIC。完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MBC。

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