【摘要】 当引物对之间的一部分序列具有同源性时会形成引物二聚体，引物二聚体的存在会造成一些问题的产生。

在本期内容中，将对引物和探针的一部分问题进行汇总。

 

当引物对之间的一部分序列具有同源性时会形成引物二聚体，引物二聚体的存在会造成一些问题的产生。因此需要确定是否有引物二聚体的存在，可通过凝胶电泳或者熔融曲线进行确定。如果是采用凝胶电泳的方法，引物二聚体会在位于 100 bp 以下的凝胶底部形成扩散条带，但是其缺点是灵敏度相对要低一些，导致结果不准确。通过熔融曲线进行区分时，引物二聚体的荧光强度比较低，在70℃附近熔融，如图1所示。

 

图 1. 熔融曲线中的引物二聚体效应

 

引物二聚体的存在对采用荧光探针的反应影响相对较小，但是对双链DNA结合染料的影响相对较大，染料的非特异性结合方式会造成反应过程中荧光强度增加，导致Ct值受影响，以致使结果出现偏差。既然引物二聚体存在一些不利的影响，可以通过降低引物浓度以及提高退火温度等来消除或者是减少反应中的引物二聚体。

 

如果没有正确保存引物和探针会造成特异性丧失或者降解。储存温度、储存时间、曝光时间、储存的引物和探针的浓度以及储存溶液的组分都会对引物和探针的储存造成影响。

 

除上述因素外，也需要注意操作的试验台要干净，在试验前最好用带核酸降解试剂的的溶液将工作台面清理干净。

 

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