【摘要】 首先介绍绝对定量法,其借助已知的标准曲线对未知样本目的模板起始量进行定量,又被称作标准曲线法。

实时荧光定量PCR技术有绝对定量和相对定量两种定量方法,绝对定量的优势在于可以对靶点的实际拷贝数进行测定,但是这种定量形式比较复杂且费力;相对定量测试的不是十分确切的拷贝数,但也需要进行周密的设计,大家可以根据自己试样的需要进行选择。

 

首先介绍绝对定量法,其借助已知的标准曲线对未知样本目的模板起始量进行定量,又被称作标准曲线法。多次连续稀释已知浓度的目标模板溶液,经实时荧光定量PCR扩增,将获得的数据生成标准曲线,横坐标是目的模板初始拷贝数的对数,纵坐标是相应的 Ct值,在该曲线的基础上生成线性回归方程,然后把未知样本的Ct值带入并计算得到目的模板的起始量。实时荧光定量 PCR 的灵敏度、目的模板、操作误差、连续稀释的实际样本的 加样准确度以及RT 和 PCR 效率均会影响实验结果[1,2]

 

图1. 标准曲线

 

标准曲线的斜率绝对值越大,间距越宽,那么扩增效率就越低,反之,斜率绝对值越小,间距越窄,则扩增效率越高。如果酶的活性存在异常或这反应体系无法促进反应的正常进行,就会表现出扩增效率过低的现象;弱国反应体系中存在多种扩增,即除了目的基因进行扩增外还存在非特异性基因扩增,则会导致扩增效率较高[3]

 

本期介绍了绝对定量法,在下期的内容中,将会继续为大家进行相对定量法的介绍。

 

  • 李萌; 李雪; 郑志强, 实时荧光定量PCR技术的应用及研究进展[J], 饲料博览. 2018,(07).

  • BUSTIN S A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays[J]. J Mol Endocrinol, 2000, 25(2): 169-193.

  • 梁子英; 刘芳,实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展[J], 现代农业科技. 2020,(06).

 

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