【摘要】 组织采集后，经固定、保存、石蜡包埋、切片、展片、烤片，方可进行HE染色(或其它化学染料染色)及免疫抗体标记。

组织采集后，经固定、保存、石蜡包埋、切片、展片、烤片，方可进行HE染色(或其它化学染料染色)及免疫抗体标记。以下操作依据组织大小及致密程度而定

 

1、组织的采集、固定和保存：

可依据实验目的及组织的特点而考虑采用不同的固定和保存方法。此处只介绍实验室常用方法。

采取组织后，4%多聚甲醛(4%PFA)4C 固定1小时(根据组织大小和致密程度调整固定时间)或过夜，PBS缓冲液洗三次，每次10min至1小时，于30%、50%乙醇中各10 min至1小时，4C保存于70%乙醇中。

 

2、组织的包埋、切片、展片及保存：

固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10m，贴于处理过的干净载玻片上，34C烤片过夜，之后收集于载片盒中，4C密封保存。

石蜡包埋：

保存于4C 70%乙醇中的组织样品

80%乙醇 15 min

95%乙醇 15 min

100%乙醇 15min 2

1/2乙醇1/2二甲苯 15 min

二甲苯透明 5-10 min

1/2二甲苯1/2石蜡 30 min

石蜡(1) 1.5hr

石蜡(2) 1.5-2.5hr

石蜡(3) 包埋

4C保存

 

3、石蜡组织切片的免疫标记：

切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水，即可进行免疫反应，操作步骤与冰冻组织切片的反应方法相同。

石蜡组织切片脱蜡、复水步骤：

密封保存于4C的组织切片

二甲苯(1) 10 min

二甲苯(2) 10 min

二甲苯(3) 10 min

1/2二甲苯1/2乙醇 15 min

100%乙醇 5 min

95%乙醇 5 min

80%乙醇 5 min

70%乙醇5 min

50%乙醇 5 min

30%乙醇 5 min

d2H2O 5 min

 

4、石蜡组织切片的HE染色：

切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水，于苏木精中室温染色5-20 min，迅速用水冲洗切片，至组织切片变蓝，镜检。用0.1-0.5%盐酸乙醇分色1～2秒钟，也可用50ml H2O中加一滴氨水分色，效果亦好(如染色程度恰好，也可省略分色步骤)。之后用流水冲洗切片，直至切片变蓝，此称蓝化。切片经梯度乙醇至95%乙醇中，于0.5%伊红中染色1～5秒或更长时间，95%乙醇洗去残色，若颜色太深，可在低浓度的乙醇中脱色，镜检。无水乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。普通光镜观察，室温干燥条件下保存染色切片。

石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水

苏木精 室温5-10 min

H2O 迅速冲洗

0.1%盐酸乙醇 1-2 sec

流水滴洗

30%乙醇 1 min

50%乙醇 1 min

70%乙醇 1 min

80%乙醇 1 min

95%乙醇 1 min

伊红A液 1min

伊红B液 1-30sec

无水乙醇 1 min

无水乙醇 5min 2

1/2乙醇1/2二甲苯 15 min

二甲苯(1) 5min

二甲苯(2) 5min

二甲苯(3) 5min

中性树胶封片，室温干燥保存

 

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